***、配制前的準備

　　1. 配方確認與計算

　　- 根據(jù)實驗目的選擇培養(yǎng)基類型(如營養(yǎng)瓊脂、LB液體、沙保弱培養(yǎng)基等)，嚴格按照標準配方稱量成分。

　　- 注意特殊成分的處理：如酵母提取物、蛋白胨需充分溶解；痕量元素(如Mg2?、Ca2?)應預先溶解后添加。

　　- 計算水量時需扣除其他液體成分(如葡萄糖溶液、維生素溶液)的體積。

　　2. 容器與工具準備

　　- 使用玻璃或耐腐蝕塑料容器(如錐形瓶、培養(yǎng)皿)，避免金屬器具直接接觸培養(yǎng)基。

　　- 器皿需提前清洗并烘干，防止水分殘留導致滲透壓變化。

　　- 磁力攪拌器、pH計、電子天平等設備需校準，確保測量精度。

　　二、配制與滅菌

　　1. 溶解與混合

　　- 按配方順序依次加入成分，先加水后加耐熱物質(zhì)(如瓊脂)，***后添加熱敏感物質(zhì)(如抗生素、血清)。

　　- 加熱時持續(xù)攪拌，避免局部過熱導致焦糊或成分分解。

　　- 瓊脂融化后需煮沸1-2分鐘，確保膠體均勻分布。

　　2. pH調(diào)節(jié)

　　- 冷卻至50-60℃時調(diào)節(jié)pH，使用精密pH計(誤差≤0.01)逐滴加入1mol/L NaOH或HCl。

　　- 避免過度調(diào)節(jié)：每滴酸堿可影響pH約0.2-0.3，需緩慢調(diào)整至目標范圍(如大腸桿菌培養(yǎng)基pH 7.0±0.2)。

　　- 高溫下pH會因蒸發(fā)而升高，需預留0.1-0.2的補償值。

　　3. 滅菌操作

　　- 高壓蒸汽滅菌：液體培養(yǎng)基121℃、15分鐘；含糖培養(yǎng)基需115℃、20分鐘以防焦糖化。

　　- 過濾除菌：適用于熱敏感成分(如胎牛血清)，采用0.22μm濾膜正壓過濾。

　　- 滅菌后立即搖勻并冷卻，避免沉淀凝結或污染。

　　三、分裝與儲存

　　1. 分裝規(guī)范

　　- 固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿時需均勻鋪展，厚度約3-5mm，避免氣泡產(chǎn)生。

　　- 液體培養(yǎng)基按實驗需求分裝(如試管裝量不超過1/5體積，搖瓶裝量為1/10)。

　　- 斜面培養(yǎng)基傾注后需靜置凝固，形成平整斜面。

　　2. 儲存條件

　　- 已滅菌培養(yǎng)基需在2周內(nèi)使用，4℃冷藏時密封避光，防止水分蒸發(fā)或污染。

　　- 含淀粉類成分的培養(yǎng)基易老化，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　- 添加劑(如抗生素、指示劑)宜單獨儲存，使用時按需加入。

　　四、接種與培養(yǎng)

　　1. 無菌操作

　　- 接種前用75%酒精擦拭工作臺面，點燃酒精燈形成無菌區(qū)。

　　- 接種環(huán)需灼燒滅菌，待冷卻后挑取菌種，避免高溫殺死目標菌。

　　- 劃線法接種時注意分區(qū)分離，第三區(qū)后不再返回前區(qū)，防止交叉污染。

　　2. 培養(yǎng)條件控制

　　- 溫度：嚴格按菌種需求設定(如大腸桿菌37℃、乳酸菌30℃、嗜熱菌55℃)。

　　- 氣體環(huán)境：厭氧菌需抽真空充氮或使用厭氧罐；CO?依賴菌需5%-10% CO?環(huán)境。

　　- 濕度與避光：培養(yǎng)箱內(nèi)放置水盤維持濕度，光敏感菌種需用黑袋包裹。

　　五、常見問題與應對

　　1. 污染控制

　　- 霉菌污染：多因滅菌不干凈或操作時間過長，需延長滅菌時間或縮短接種流程。

　　- 細菌污染：可能來自吸管、槍頭或空氣，需更換無菌耗材并加強超凈臺維護。

　　- 支原體污染：定期檢測細胞系，使用含青霉素、支原體清除劑的培養(yǎng)基。

　　2. 培養(yǎng)基異常

　　- 不凝固：瓊脂濃度不足或pH過高，需補加瓊脂并重新滅菌。

　　- 顏色變化：指示劑失效或成分氧化，應檢查原料有效期并避光保存。

　　- 菌落形態(tài)異常：滲透壓偏差或缺乏生長因子，需復核配方并補充酵母提取物等。

　　六、特殊培養(yǎng)基的使用要點

　　1. 選擇性培養(yǎng)基(如麥康凱瓊脂)：

　　- 膽鹽、結晶紫需溶解，抑菌劑濃度需精確控制。

　　- 目標菌(如大腸桿菌)應形成典型菌落，抑制雜菌生長。

　　2. 鑒別培養(yǎng)基(如伊紅美藍瓊脂)：

　　- 顯色反應需在規(guī)定時間內(nèi)觀察，避免過度曝光導致顏色掩蓋。

　　3. 富集培養(yǎng)基(如GN增菌液)：

　　- 專性菌種優(yōu)先增殖，需配合選擇性平板進行二次分離。

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